【摘要】表面等离子体共振(SPR)技术作为一种强大的生物物理工具，在分子垂钓领域展现出 卓越的应用价值。分子垂钓是药物研发的前沿技术，在药物发现中发挥着重要作用，该技术凭借其 高灵敏度、高特异性、实时活性监测、自动化进样和回收能力，结合高分辨质谱的鉴定功能，不仅 可以用于从细胞裂解液中筛选和捕获蛋白质等生物大分子，还能应用于中药和天然产物提取液中小 分子化合物的垂钓。在复杂的粗样本原液中特异性的垂钓发掘出高价值的分子和活性成分的独特能 力使得分子垂钓技术成为现代生物医药和食品行业中备受关注的技术。本文详细阐述了基于 SPR 的 分子垂钓技术原理，全面综述了其在药物研发、生物医学研究、中药成分筛选及作用机制探究等多 个领域的应用情况，深入探讨了实验中的关键因素，并对该技术面临的挑战与未来发展趋势进行了 展望。 

1、引言 

随着生命科学与生物技术的迅猛发展，深入了解分子间相互作用机制对于诸多领域的突破至关 重要。SPR 技术凭借其能够实时、无标记且高灵敏地监测分子间结合与解离过程的特性，成为分子 垂钓的得力手段，为解决复杂的生物学和药学问题提供了新途径。分子垂钓是药物研发的前沿技 术，被广泛应用于新目标和活性成分的检测，在药物发现中发挥着重要作用，具体的作用包括发现 未知的新靶点和识别药物已知的作用位点。此外，当天然产物的目标难以确定时，分子垂钓技术可 以识别其有效的单体组分。分子垂钓技术通过直接筛选细胞提取物来寻找和识别可能与诱饵配体相 互作用的分子，为药物靶点发现的研究奠定了良好的基础。 

2、基于 SPR 的分子垂钓技术原理 

SPR 现象基于金属薄膜表面等离子体与入射光的共振耦合，当入射光特定角度照射到镀有金属 膜(如金膜)的传感芯片表面，且表面附近介质折射率发生变化时，会引发反射光强度的急剧改 变，通过监测这一变化可实时追踪分子结合与解离动态。基于 SPR 的分子垂钓技术基本原理就是从 中药煎剂、中草药提取物或化合物库等复杂混合物中“钓取”可以与配体结合的分子。在分子垂钓 应用中，将靶标分子(如蛋白质、核酸等)固定于芯片表面，注入含待检测分子的样品溶液，若两者发生特异性结合，芯片表面折射率改变，SPR 信号响应，垂钓出混合样品中与靶蛋白结合的分子， 

最后利用质谱对回收到的样品进行鉴定[1]。在这些研究中使用 SPR 生物传感器，可以解决以下任务: (a)基于 SPR 选择特定生物样品最有效亲和分离所需的固定化条件;(b)基于 SPR 的分子垂 钓，用于随后通过质谱进行蛋白质鉴定;(c)基于 SPR 验证已鉴定蛋白质与固定化配体的相互作 用。 

3、基于 SPR 的分子垂钓应用领域 

3.1 药物研发 

SPR 技术可快速筛选大量化合物与潜在靶点蛋白的相互作用。例如，在抗癌药物研发中，将癌 相关蛋白固定于芯片，与小分子化合物库进行垂钓实验，能精准定位可抑制该蛋白活性的先导化合 物，测定先导化合物与靶点的亲和力常数(KD)、结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)等动 力学参数，直观反映结合的紧密程度与稳定性。通过不断调整化合物结构并重复垂钓测试，筛选出 亲和力更强、药代动力学性质更佳的候选药物，提高药物研发成功率,进而确定全新的药物靶点，为 后续药物设计开辟方向[2,3]。如中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉学科研究中心团队[4] 预测 STAT3 为雷帕霉素的直接功能性蛋白质靶标，通过分子垂钓确认该假设，并发现雷帕霉素同时 降低 STAT3 和 c-myc 的表达，还在肝细胞癌的异种移植小鼠模型中验证了结论，为癌症治疗的 STAT3 抑制剂的药理学和药物开发提供重要信息。暨南大学医学院费嘉教授团队[5]通过 SPR-MS 技术鉴定小 檗碱作用靶点 UHRF1，将小檗碱固定到传感芯片上，加入细胞裂解液孵育，垂钓靶蛋白并回收，经质 谱鉴定，确定 UHRF1 为小檗碱的潜在作用靶点，并通过 SPR 和分子对接验证了相互作用。 

Patching SG[6]研究了 SPR 技术在 G 蛋白偶联受体配体筛选中的应用，通过分子垂钓筛选出与特定 G 蛋白偶联受体具有高亲和力的配体分子，为开发针对该类受体的药物提供了重要的筛选工具。上海 第二军医大学药学院 Cao Y 等[7]描述了一种基于 SPR 的灵敏、高效、便捷的方法的建立和应用，用于 从中草药中筛选靶向肿瘤坏死因子受体 1 型(TNF-R1)的活性成分。调整中草药提取物浓度进行 SPR 结合试验，在大黄提取物中观察到显著的响应信号。然后，回收、富集 TNF-R1 结合成分，并 通过 UPLC-QTOF/MS 进行分析,鉴定出 hyscon-8-O-β-D - 单葡萄糖苷(PMG)为生物活性化合物， 并通过 SPR 亲和力分析确定 PMG 对 TNF-R1 的亲和力常数。 

3.2 生物医学研究 

研究细胞内信号传导通路时，依次固定不同的信号蛋白，垂钓与之相互作用的上下游蛋白，逐步勾 

勒出复杂的蛋白质相互作用网络，助力揭示细胞生理功能调控机制以及疾病发生发展的分子基础 Alexis S,Ivanov 等人[8]使用了结合亲和分子垂钓和后续质谱的方法，研究了与固定化微粒体细胞色 素 b5(CYB5A)相互作用的人类肝脏蛋白质，结果表明直接分子垂钓适用于分析正常和病理条件下 的蛋白质 - 蛋白质相互作用，这对医疗领域中研究疾病状态下的蛋白质相互作用具有重要意义。石 河子大学新疆植物药资源利用教育部重点实验室的研究团队选择 TNF-α为靶点，利用 TNF-α 芯 片，“垂钓” 中草药提取物中的活性分子，并用 LC-MS 进行鉴定得到 3 种活性分子，随后测定了 三种活性分子与靶点 TNF-α 的亲和力，明确其结合能力，最终在细胞水平证明其 TNF-α 抑制剂 的作用。 

  针对特定疾病，将疑似生物标志物分子(如特定蛋白或核酸片段)固定于芯片，从患者血液、

脑脊液等生物样本中垂钓与之结合的内源性分子，经鉴定后发现新的生物标志物，用于疾病早期诊

断、病情监测及预后判断。Savitha,K [9]使用 SPR 技术对乳腺癌进行早期检测。模拟结果显示正常细胞和 癌细胞的波长光谱发生明显变化，这种基于 SPR 的传感器非常灵敏，是生物医学应用的最佳选择。Huimin 

Lei[10]在霍奇金淋巴瘤(HL)的研究中，构建了一系列网络模型，包括背景网络、HL 基本网络和特定于 HL 的网络。通过分析这些网络，研究了 HL 相关蛋白的连接特性。发现 HL 相关蛋白质更可能彼此连接，并且作 为 HL 特定网络的骨干，可以进一步将 HL 特定网络分为五个子网和 49 个蛋白质，它们可能与 HL 密切相关。 此外，还发现蛋白质对的共调度是 HL 特定网络中蛋白质网络上 miRNA 的主要调节模式。根据 miRNA 对蛋 白质网络的调节，鉴定出 5 个核心 miRNA 为潜在的 HL 诊断生物标志物。 

3.3 中药研究 

鉴于中药成分复杂多样，SPR 技术提供了高效筛选途径。以某单味中药或复方提取物为样品， 针对特定病症相关靶标(如炎症相关细胞因子受体)进行垂钓，结合质谱等技术可快速锁定具有活 性的小分子成分，如从清热解毒类中药中垂钓出黄酮类、萜类等抗炎活性成分。 

海军医科大学药学院药物代谢产物研究上海重点实验室 Zhang Y 等[11]构建了基于表面等离子共 振技术(SPR)的双靶点中草药分析体系，将 Spike RBD 蛋白和 ACE2 蛋白分别偶联在芯片的不同 通道上，“垂钓”出中草药提取物中的活性分子，发现葛根素与 Spike RBD 蛋白、ACE2 蛋白都能 特异性结合。为探索中草药活性成分的靶向疾病治疗机制提供了一种新思路。 

福建省片仔癀天然医药研发企业重点实验室联合福建中医药大学[12]建立了一种基于 SPR 垂钓技 

术来分析安宫牛黄丸的质量标志物的方法，利用 UPLC-Q-TOF-MS 分析安宫牛黄丸主要化学成分，采 用网络药理学预测潜在靶点，构建 STAT3 蛋白芯片进行垂钓回收，分析鉴定出 10 种潜在的活性成 分，并确定了其对 STAT3 靶点的亲和动力学参数。海军军医大学团队[13]，将携带膜蛋白 CXCR4 的 慢病毒颗粒固定在 CM5 芯片上，对川芎、穿心莲、苦楝子的草药提取物进行 SPR 分子垂钓，串联 UPLC-QTOF-MS 技术，鉴定到来源于川芎的洋川芎内酯 I，并证明其与 CXCR4 蛋白的相互作用。第 二军医大学联合上海大学团队[14]，分别将 TNF-R1、TNF-α 偶联到 CM5 芯片上，表征芯片活性和特 异性后，将白芍提取物按照不同比例稀释后进样，垂钓回收与 TNF-R1 结合的成分，再通过 UPLC- QTOF/MS 分析鉴定，最后用 SPR 技术进一步确认芍药苷和丹皮酚与 TNF-R1 的相互作用。 

确定中药活性成分后，进一步利用 SPR 精确测定其与靶标的亲和力、结合位点等细节，结合细 胞实验和动物模型，深入解析中药成分如何通过干预靶标分子发挥药效，揭开中药传统理论的现代 科学内涵，推动中药现代化进程。 

4、基于 SPR 的分子垂钓实验关键因素 

4.1 靶标分子的选择与固定 

依据研究目的，优先选择与疾病紧密关联、功能明确且具有可成药性的分子作为靶标。例如在 肿瘤研究中，常聚焦于癌基因产物、肿瘤抑制因子等;在抗感染研究中，则选取病原体关键入侵蛋 白或宿主免疫相关受体。化学偶联法可实现牢固结合，常用 NHS/EDC 等试剂，不过操作需精细控制 避免影响靶标活性，需根据靶标特性灵活抉择。 

4.2 样品制备与处理 

高纯度样品能减少非特异性吸附干扰，提高信号的准确性。对于生物样本，需通过超滤、色谱 等技术去除杂蛋白、核酸等杂质;对于化学合成样品，要严格控制合成副产物含量。同时缓冲液的 pH 值、离子强度、渗透压等参数对分子间相互作用也影响显著。合适的缓冲液应模拟生理环境，维 持靶标与待测分子的活性，同时避免促进非特异性结合，通常需经过预实验优化筛选。 

4.3 实验设计与数据分析 

  设立阴性对照(如仅固定基质无靶标分子)和阳性对照(已知强结合物与靶标组合)，有效甄别假阳性与假阴性结果，确保实验数据的可靠性。然后依据 SPR 仪器输出的传感图，运用专 

业软件(如 SPR Analysis )拟合曲线，准确计算动力学参数、亲和力数据，结合统计学方法深入挖 掘数据背后的生物学意义。 

5、基于 SPR 的分子垂钓的优势与局限性 

5.1 SPR 技术在分子垂钓中的优势 

5.1.1 高效性:表面等离子体共振(SPR)生物传感器是一种高效的仪器，适用于分子相互作用 的直接实时配准，而无需额外使用任何标签或偶联方法[11]，可以快速、准确地检测分子间的相互作 用，提高了分析的效率。例如，在研究复杂生物系统中分子间相互作用时，SPR 生物传感器能够快 速筛选出潜在的相互作用分子，为后续的研究提供了有力的支持。 

5.1.2 特异性强:SPR 技术在分析各种配体受体相互作用时特别有效。这是因为 SPR 生物传感 器能够检测到分子间的特异性结合，从而排除非特异性结合的干扰。例如，在蛋白质相互作用的研 究中，SPR 技术可以准确地检测到特定蛋白质之间的相互作用，为研究蛋白质的功能提供了重要的 依据。 

5.1.3 微量检测:SPR 技术具有微量检测的优点，能够检测到极少量的生物分子[12]。这对于研究 生物体内微量的生物分子相互作用具有重要的意义。例如，在研究细胞信号传导、受体-配体、抗 体-抗原分子垂钓等生命科学领域时，SPR 技术可以检测到微量的生物分子，为研究这些领域提供了 有力的工具。 

5.1.4 实时监测:SPR 技术能够实时监测分子间的相互作用，为研究分子间的动态变化提供了有 力的支持[11]。例如，在研究蛋白质相互作用的动力学过程中，SPR 技术可以实时监测蛋白质之间的 结合和解离过程，为研究蛋白质的功能提供了重要的依据。 

5.1.5 适用性广:SPR 技术已被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号传导、受体-配体、抗体-抗原 分子垂钓、免疫识别、癌症研究和新药筛选等生命科学领域。这表明 SPR 技术具有广泛的适用性， 可以应用于不同的研究领域。例如，在海洋糖类物质的活性研究中，SPR 技术已成功用于海洋糖类 化合物作用靶点确定、亲和力测定及糖类抗体研究等方面[13]。 

5.2 SPR 技术在分子垂钓中的局限性 

5.2.1 复杂样品分析困境:面对生物体内高度复杂的样本(如全血、组织匀浆)，非特异性吸附严重，信号易受干扰，精准识别特异性结合信号难度大增。 

5.2.2 通量瓶颈:传统 SPR 设备单次检测样本量有限，在大规模化合物筛选、多靶标平行研究 场景下效率较低，难以满足高通量需求。 

6、展望 

6.1 技术联用突破:与微流控技术结合，实现样品微量化、自动化处理，降低非特异性吸附;与 质谱联用，实时鉴定垂钓所得分子，拓展信息获取维度，提升复杂样品分析能力。 

6.2 高通量设备革新:研发新一代高通量 SPR 系统，同步检测多个样本或靶标，大幅提升通 量，加速药物研发与生物标志物发现进程。 

6.3 普及应用推进:通过技术改进、规模化生产降低成本，开发操作简易的仪器平台，配套完善 的培训服务，促使 SPR 技术在更多领域生根发芽，助力科研与产业发展。 

7、结论 

SPR 技术在分子垂钓领域已取得丰硕成果，广泛渗透至药物研发、生物医学、中药研究等核心 阵地，为破解分子相互作用谜题提供关键支撑。尽管当前面临复杂样品、通量及成本等挑战，但随 着技术创新与联用策略的深入实施，未来有望迎来新的飞跃，持续为生命科学前沿探索与应用转化 注入强大动力。 

8、参考文献 

[1]Ivanov AS, Medvedev AE. Optical surface plasmon resonance biosensors in molecular fishing. Biomed Khim. 2015 Mar-Apr;61(2):231-8. Russian. doi: 10.18097/PBMC20156102231. PMID: 25978389. 

[2]Chavanieu Alain,Pugniere Martine. "SPR 片段筛选的发展." Expert opinion on drug discovery 5(2016). [3]助力药物研发 -NeoSPR-M100 生物分子相互作用分析仪,北京赛泰克生物, 

https://www.chem17.com/st99132/article_3598967.html[4]Sun L, Yan Y, Lv H, Li J, Wang Z, Wang K, Wang L, Li Y, Jiang H, Zhang Y. Rapamycin targets STAT3 

and impacts c-Myc to suppress tumor growth. Cell Chem Biol. 2022 Mar 17;29(3):373-385.e6. doi: 

10.1016/j.chembiol.2021.10.006. Epub 2021 Oct 26. PMID: 34706270.[5]Gu C, Yin Z, Nie H, Liu Y, Yang J, Huang G, Shen J, Chen L, Fei J. Identification of berberine as a novel 

drug for the treatment of multiple myeloma via targeting UHRF1. BMC Biol. 2020 Mar 25;18(1):33. doi: 10.1186/s12915-020-00766-8. PMID: 32213189; PMCID: PMC7098108. 

[6]Patching SG. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 2014 Jan;1838(1 Pt A):43-55. doi: 10.1016/j.bbamem.2013.04.028. Epub 2013 May 9. PMID: 23665295. 

[7]Cao Y, Li YH, Lv DY, Chen XF, Chen LD, Zhu ZY, Chai YF, Zhang JP. Identification of a ligand for tumor necrosis factor receptor from Chinese herbs by combination of surface plasmon resonance biosensor and UPLC-MS. Anal Bioanal Chem. 2016 Jul;408(19):5359-67. doi: 10.1007/s00216-016- 9633-6. Epub 2016 May 25. PMID: 27225174. 

[8]Alexis S Ivanov,Alexei Medvedev,Pavel Ershov,Andrey Molnar,Yury Mezentsev. "Protein interactomics based on direct molecular fishing on paramagnetic particles: practical realization and further SPR validation." Proteomics 20(2014). 

[10]Huimin Lei,Wenxu Liu,Jiarui Si,Ju Wang,Tao Zhang.Analyzing the regulation of miRNAs on protein- protein interaction network in Hodgkin lymphoma BMC Bioinformatics 1(2019). 

[11]Zhang Y, Wang D, Wang X, Ma H, Liu Y, Hong Z, Zhu Z, Chen X, Lv D, Cao Y, Chai Y. A dual-target SPR screening system for simultaneous ligand discovery of SARS-CoV-2 spike protein and its receptor ACE2 from Chinese herbs. J Pharm Biomed Anal. 2024 Aug 1;245:116142. doi: 10.1016/j.jpba.2024.116142. Epub 2024 Apr 9. PMID: 38631070. 

[12]Yuan HJ, Chen XY, Chen PZ, Zhang JR, Zhang RS, Xu W, Xu W, Lin XH, Luo ZY. [Prediction of quality markers of Angong Niuhuang Pills based on LC-MS and pull-down with SPR chips]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2024 Apr;49(7):1848-1864. Chinese. doi: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20240109.301. PMID: 38812197. 

[13]Chen L, Lv D, Wang S, Wang D, Chen X, Liu Y, Hong Z, Zhu Z, Cao Y, Chai Y. Surface Plasmon Resonance-Based Membrane Protein-Targeted Active Ingredients Recognition Strategy: Construction and Implementation in Ligand Screening from Herbal Medicines. Anal Chem. 2020 Mar 3;92(5):3972- 3980. doi: 10.1021/acs.analchem.9b05479. Epub 2020 Feb 20. PMID: 32045214. 

[14]Lv D, Xu J, Qi M, Wang D, Xu W, Qiu L, Li Y, Cao Y. A strategy of screening and binding analysis of bioactive components from traditional Chinese medicine based on surface plasmon resonance biosensor. J Pharm Anal. 2022 Jun;12(3):500-508. doi: 10.1016/j.jpha.2021.11.006. Epub 2021 Dec 1. PMID: 35811628; PMCID: PMC9257445.